Né à Anaheim dans le comté d'Orange, Milo Ventimiglia est le fils de Peter Ventimiglia, italien d'origine sicilienne, et de Carol Wilson, qui possède des ascendants irlandais, anglais, écossais, français, cherokees, indiens et pieds-noirs. Il est le dernier de trois enfants et a deux s½urs.

Il commence à jouer dans des comédies à douze ans. Après des études au El Modena High School d'Orange dont il est diplômé en 1995, il obtient une bourse pour le programme d'été du conservatoire d'art dramatique de San Francisco (American Conservatory Theater) puis entre à la prestigieuse UCLA. Remarqué par la responsable du casting de Gilmore Girls qui lui donne le rôle de Jess Mariano, il devait apparaître dans 2 ou 3 épisodes seulement mais son personnage prend de l'importance et sera présent dans les deuxième et troisième saisons ainsi que dans quelques épisodes des saisons 4 et 6. Sur le tournage de la série, il tombe sous le charme de Alexis Bledel, héroïne de la série (Rory Gilmore),ils resteront ensemble pendant trois ans et demi. Ils se séparent en juillet 2006.

En 2006, il est à l'affiche de Rocky Balboa — de et avec Sylvester Stallone — où il interprète le fils de Rocky. Il fut choisi notamment pour sa gêne à la lèvre gauche — un défaut de naissance —, qui rappelle le visage de Stallone. Il tourne actuellement dans la série Heroes, une série à succès aux États-Unis dans laquelle il incarne Peter Petrelli. Il est également sorti avec Hayden Panettiere (Claire Bennet) sa partenaire dans la série Heroes de douze ans sa cadette. Il sortirait avec Isabella Brewster, soeur de l'actrice Jordana Brewster.